目的 解决野生型黑曲霉产药用柠檬酸的产量瓶颈，提升其工业化生产效率，为药用柠檬酸高效发酵提供技术支撑与菌株资源。方法 采用 CRISPR/Cas9 技术，靶向敲除黑曲霉 glgC 与 oahA 基因，构建双基因敲除工程菌并鉴定；通过单因素实验筛选碳源、培养温度、氮源浓度等关键发酵因子，结合 Box-Behnken 设计进行响应面优化，采用 HPLC 法测定柠檬酸产量。结果 成功获得黑曲霉双基因敲除阳性工程菌，PCR 及测序鉴定证实目标基因编码区缺失；单因素实验筛选出葡萄糖、30℃、2 g/L 氮源浓度为最优单因素水平；响应面优化后，三因素均为中间水平时柠檬酸产量达峰值，显著高于单因素实验。结论 双基因协同敲除联合响应面优化策略可有效提升药用柠檬酸发酵产量，该策略可行有效，为药用柠檬酸工业化生产提供了优质菌株与技术方案，也为同类药用有机酸发酵优化提供参考。